课程回顾│肠道菌群相关疾病的最新研究思路及方法
非常感谢大家的关注，科技君于3月30日主办的第一期线上免费微课——《肠道菌群相关疾病的最新研究思路及方法》，已经圆满结束，在朝夕日历平台上实现1100+用户同时在线。科技君已经被童鞋们学习的热情深深打动啦，以后还会不定期举办不同主题的线上微课，欢迎继续关注。
下面为大家展示课程的精华内容，错过的小伙伴可以抓住机会重温下！（文末有福利~）
本次跟大家分享的微课主题是《肠道菌群相关疾病的最新研究思路及方法》，主要内容包括：1）肠道菌群研究概述；2）肠道菌群相关疾病研究进展；3）肠道菌群相关疾病研究方案。
一、肠道菌群研究概述
肠道菌群是一个非常庞大的群体，在一个健康的成年人体内，肠道菌群总重量可达1.5千克，其中包含的细胞数量高达1014个，是人体细胞数目的10倍。
目前已发现的肠道菌群物种数目多达4万种，其中99%以上都是细菌，而且绝大多数是厌氧菌；迄今为止的最新非冗余人肠道meta基因集大小是11.4M，包含了1500多份来自不同国家不同人群的肠道菌群信息和500多个已发布的肠道菌群物种的基因，是一个近乎完整的人肠道meta基因集，其中的基因数目远远超过了人体基因数目的100倍。
另外肠道菌群个体间差异高达80%-90%，主要是菌种水平上的差异。而且肠道菌群的结构会受到很多因素的影响，包括宿主遗传因素、地理因素、饮食、生活习惯、健康状况、药物使用等等；这一方面增加了肠道菌群研究的复杂性，另一方面也为肠道菌群研究在精准医疗和个性化医疗时代的发展带来了很好的机会。
近年来与肠道菌群相关的疾病研究迅速发展，有近90%的疾病都有可能与肠道菌群相关。
和肠道菌群相关的疾病研究多为以下六大类：1）消化道类疾病，包括腹泻、便秘，肠易激综合征、炎症性肠炎IBD、结直肠癌等；2）代谢性疾病，包括肥胖、二型糖尿病T2D等；3）肝脏类疾病，包括肝硬化、脂肪肝、酒精肝、肝癌等；4）免疫类疾病，包括类风湿性关节炎、强制性脊髓炎等；5）肺部疾病，包括哮喘、慢性肺病、肺部感染等；6）精神类疾病，包括自闭症，抑郁症、老年痴呆、精神分裂等。
肠道菌群并不是一个孤立的存在，作为一个长期以来被忽略的“器官”，肠道菌群与我们身体的其他器官（包括脑、肾、肝、肺、心、皮肤等）有着密切的联系，参与人体生命活动的各个途径，包括脂肪储存、血管生成、免疫系统的发育和成熟、某些维生素和非必需氨基酸的合成、药物代谢、神经调节、食物消化和营养吸收、病原菌抵抗、上皮损伤修复、骨骼生成及骨代谢等。这些功能及其对应的pathway可以为肠道菌群相关机制的研究提供依据。
肠道菌群研究的迅速发展与国家层面的大力支持是密不可分的，一些突破性进展也都是在这些计划下产生的。如2008年前后分别由美国主导的人体微生物组计划HMP和欧盟主导的人类肠道宏基因组计划metaHIT为行业的发展做出了重要的贡献。此外2016年启动的美国国家微生物组计划，是奥巴马政府继脑计划、精准医学、抗癌“登月”之后推出的又一个重大国家科研计划，可见微生物组研究的重要程度。除此之外，美国、欧盟、法国、加拿大等国家还有一些其他的肠道菌群相关计划；我国科学家也呼吁应该尽快启动中华民族人体微生物组计划，希望该项研究能为预防疾病、改善中国民众健康、推动中国传统医药升级换代和走向世界作出独特的贡献。
在国家的大力支持下，肠道菌群研究已然成为科研界最火爆的领域之一。近些年来各大权威学术期刊，发表了一系列肠道菌群相关的重磅研究文章。分别从不同的角度揭示了肠道微生物组在人类健康和疾病中发挥着至关重要的作用。以上图表可以看出2010年以来肠道菌群相关文章呈爆发式增长。
除了在科研界掀起热潮之外，肠道菌群也引来很多社会资本的注资布局。目前社会资本青睐的领域主要是以下三个：1）微生物检测，包括人体不同部位、不同发育时期的微生物检测以及健康指导；该检测类似于目前修行的基于人体基因组学的遗传咨询。2）粪便移植和粪便银行等，粪便移植是肠道菌群在临床上最直接的应用，不过目前应用范围仍然较窄，比较成熟的是用粪便菌群移植治疗由艰难梭菌引起的顽固性腹泻，这一策略也已被纳入美国的治疗指南。3）微生物制剂/药物研发，由于粪便移植应用的局限性，相应的肠道微生物制剂开发以及以肠道菌群为靶点的药物研发也是一个重要的应用方向。
虽然目前这三个应用领域都还处于起步阶段，但他们的前景却是非常好的。业内人士预计在整个二代测序分子诊断的市场规模中，微生物基因组的市场规模将达百亿以上。
二、肠道菌群相关疾病研究进展
肠道菌群相关疾病研究进展：结合已经发表的高分文章分析肠道菌群相关疾病研究进展。
2.1 案例1：中国人糖尿病
文章亮点：
1） 参考全基因组关联分析（GWAS）的方法首次提出宏基因组关联分析的方法，即MWAS（metagenome-wide association studies，宏基因组关联分析）；
2） 采用MLG的虚拟物种概念，可以同时对肠道菌群的已知物种和未知物种进行研究；类似的虚拟物种概念还有MGS、mOTU等，他们在宏基因组物种研究层面上得到了广泛的应用。
3） 参照GWAS的研究策略，分两个阶段进行研究。第一阶段采用小量样本研究筛选得到和疾病相关联的肠道菌群marker（基因、物种、功能）；第二阶段在更大量的样本研究中对这些marker进行验证，并整合两个阶段的结果进行分析。
这研究开创了宏基因组关联分析方法，为宏基因组相关疾病研究的发展提供了很好的方法学参考。不过可能因为宏基因组研究测序成本较高，后续的研究很少采用两个阶段的研究策略，研究者更倾向于选择前人的研究数据进行验证。
2.2 案例2：欧洲人糖尿病
文章亮点：
1）在项目设计和结果分析方面都更多考虑了临床情况：①在项目设计方面增加了糖耐量损伤患者组。糖耐量损伤是T2D前期症状，增加这个分组可以研究肠道菌群在糖尿病病程发展中的作用。②在分析中增加了相关临床指标和疾病marker的关联分析，用临床指标验证相关marker的准确性。
2）选用上一个案例中的中国人糖尿病数据来验证他鉴定的肠道菌群marker的分类效果，结果发现在这项研究中得到的分类marker对中国人糖尿病样本的分类效果并不好。这是一个非常合理的结果，因为我们前面提到过人与人之间的肠道菌群差异是非常大的，而中国人和欧洲人在遗传、地理、饮食、生活习惯上都有着非常大的差异。这也提醒我们在肠道菌群的研究中不能未经验证直接将他人的的研究结果加以应用，在更深入的研究以及应用之前需要严格验证相关的结果是否符合自己的样本情况。特别是像我们国家这种国土面积大的多民族国家，不同地区的研究结果可能都不是通用的。
2.3 案例3：糖尿病/二甲双胍治疗
文章亮点：
1）研究者选用之前发表的中国人糖尿病和欧洲人糖尿病相关数据进行另一个角度的分析，除关注T2D患者肠道菌群紊乱之外，还关注二甲双胍治疗对这一紊乱状态的缓解。结果发现二甲双胍治疗可以改善T2D患者的肠道菌群紊乱状态。
2）将肠道菌群的功能和二甲双胍的作用机制进行关联；从肠道菌群的角度对二甲双胍治疗糖尿病以及一些副作用产生的机制进行解释。这是一个新的研究药物作用机制的思路。特别是对作用机制不明的药物，如我国传统的中药制剂。
2.4 案例4：中药治疗二型糖尿病
文章亮点：
1） 方案设计：选择了187例T2D患者，用不同剂量的药物进行治疗并增加安慰剂组作为对照；在药物干预的0周、第四周、8周、12周分别收集样本进行检测。改方案设计综合考虑了药物剂量和药物作用时间对研究的影响，值得参考，不过由于相关实验方案临床患者接受度低，在临床实现上可能会有一定的难度。
2） 通过药物干预不同阶段的肠道菌群研究，分析肠道菌群改变与症状缓解出现的先后顺序，这个先后顺序可能在一定程度上代表了肠道菌群和症状缓解的因果关系，该项分析的实现和前期方案设计是分不开的。
3）将研究对象定位到了某一特定菌株，并通过qPCR对该菌株与药物治疗及临床指标的关联进行了验证。这是以作者深厚的研究基础做支撑的，在前期研究中作者通过复杂的信息分析过程将研究对象对应到核心菌株的。有利于在菌株水平上研究特定菌株在疾病发展中的作用及其机制。
2.5 案例5：肠道细菌作用机制研究
文章亮点：
接该案例从动物实验和分子实验的水平上研究目标菌株厌氧消化链球菌（Peptostreptococcus anaerobius）在结直肠癌肿瘤发生中的作用以及他的作用机制。该目标菌株是在前期宏基因组关联分析的基础上选择得到的。
试验方法：组织病理学、qPCR、 Western Blot 、细胞增殖实验（MTT）等。
2.6 案例6：多组学研究
随着相关研究的发展，多组学研究也成为肠道菌群研究的趋势。如可以通过肠道菌群和人基因组关联分析，研究遗传因素对肠道菌群的影响；通过宏基因组和蛋白质组学或代谢组学关联分析研究肠道菌群在人体相关蛋白表达或代谢途径中的作用。
本案例是通过宏基因组和代谢组关联分析，研究肠道菌群和某些关键代谢物的关联，最终从菌株水平解析代谢类疾病胰岛素抵抗的发生机制。
综上所述，肠道菌群相关疾病的研究经历了一个从菌群到菌株、从关联到因果、从表型到机制、从单组学到多组学的一个发展过程。
三、肠道菌群相关疾病研究方案
接下来是研究方案分享部分，在前面的研究进展分享中我们应该已经对肠道菌群的研究方案有了初步的了解；在这一部分我们主要分步骤介绍一下相关的方法和可能需要注意的问题。
3.1 群体选择
根据我们前面的案例，在肠道菌群相关疾病研究中，我们可以直接选择疾病组和健康组来进行研究；如果有疾病进展信息或药物干预情况，我们可以增加相应的分组，以获得更多的信息。
由于肠道菌群会受到各种因素的影响，为了保证分析结果的可靠性，我们在群体选择过程中需要严格进行相关条件控制。如果有的条件难以控制，比如年龄或BMI等，请务必如实详细记录对应的信息，这样在后续分析中可能通过相应的分析方法一定程度上降低这些因素的影响。
群体大小，推荐每组50个样本以上。
3.2 样本选择
样本类型：粪便样本、肠粘膜样本。
粪便样本代表肠腔微生物，由于取样简单、样本量大，是我们目前研究的主要样本来源，市场上也有很多相关的粪便样本采集试剂盒可以选用。
肠粘膜样本代表肠粘膜定植微生物，和肠腔的微生物菌群的数量和类型有一定的差别，粘膜相关菌群可能与肠道正常功能和疾病关联度更高。目前由于研究粘膜相关菌群技术上的复杂性，如宿主污染严重，样本量少等；肠粘膜样本可能只适用于16S做菌种研究。
3.3 基因测序
测序方法：16S测序、宏基因组测序
16S测序：只能进行物种水平的研究，该方法操作简单、价格便宜；在不明确某一疾病和肠道菌群的关系时，可以先通过16S测序进行初步筛选，为后续更深入的研究提供依据。
16S测序针对肠道细菌研究，如需研究肠道真菌，请选择ITS或18S测序进行研究。
宏基因组测序：可获得肠道细菌、真菌、病毒等物种的包括基因、物种和功能信息，该方法广泛应用于肠道菌群数据挖掘以及肠道菌群相关疾病发生机制或药物作用机制的研究等。
3.4 数据分析
数据分析：对肠道菌群相关疾病研究来说，我们关注的是疾病相关的肠道菌群的marker，分基因、物种和功能层面；在这个过程中选择合适的数据库和方法是非常重要的。
基因注释：可直接选用已发表的人肠道参考基因集（如IGC，Integrated Gene Catalog）；
物种注释：可选用通用物种数据库物种库、也可以选择MLG/mOTU或MGS这些虚拟的物种概念进行物种研究。此外，还可以通过组装获得高丰度物种草图。
功能注释：如KEGG，eggNOG，ARDB，CARD，CAZy，PHI，VFDB等。功能数据库数据库版本越高注释结果越可靠；
目前越来越多的研究将肠道菌群marker和临床指标相关联，如果需要做这一部分的分析，请在样本采集过程中务必详细记录相关的表型信息和一些影响因素，以保证后续分析结果的准确性。
3.5 结果验证
为了保证结果的可靠性，除了不断优化分析方法以外，还需要对结果进行验证，验证方法包括：临床指标、多组学和实验验证等。
本次微课的分享暂时就到这里，接下来科技君还会继续分享人肠道宏基因组与疾病相关的CNNS文献解读，请留意！
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华大实力（宏基因组）：
1. 已测序样本10000＋；
2. 发表宏基因组文章50+，CNNS系列21篇；
3. 可针对客户的研究问题提供个性化解决方案。
不少童鞋反馈由于工作原因没赶得上收听微课，科技君在这里附上当天微课的直达链接：http://dwz.cn/5FqsRN。错过的童鞋可以登录直播间回听。
另外，由于课程语音、PPT及相关文献（包括HMP人meta样本取样指南）文件过大，已经上传云盘，需要源文件的童鞋可以后台回复“资源”获取下载地址。
撰稿：张 义
编辑：市场部
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